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固相萃取技术及其在生物样本分析中的应用与进展

点击次数:97  发布时间:2019-01-16
  近20年来,仪器分析得到了迅猛发展,尤其是计算机和微处理技术的进步,使分析方法自动化成为可能。就生物样本的分析而言,分析过程包括采样、样本贮存、样本制备、待测物的分离和鉴别以及后的定量分析。在这一系列过程中,样本制备始终是为复杂、繁琐却又为关键的一步。因为在此期间,需要对样本进行分离、净化和浓集。目前,常用的样本制备方法仍是液-液萃取(LLE)的方法。但是,它耗时较长,需要样本的量较大,处理时采用大量有机溶剂,易形成乳化,造成样本的损失。与此同时,由于液相色谱,特别是反相液相色谱的成功应用,使人们利用色谱理论,采用装有不同填料的小柱进行样本制备的固相萃取(亦称液-固萃取)技术(SPE)日益受到重视。该技术于70年代初引入分析中,它大大缩短了样本制备时间,所需样本量少,避免了乳化现象,而且便于自动化操作,真正实现了生物样本分析的率。
 
  1、SPE方法
 
  SPE的基本模式 SPE的基本原理是样品在两相之间的分配,即在固相(吸附剂)和液相(溶剂)之间的分配。其保留或洗脱的机制取决于被分析物与吸附剂表面的活性基团,以及被分析物与液相之间的分子间作用力。有两种洗脱模式,一种是被分析物比所存在的生物介质与固相之间的亲和力更强,因而被保留,然后用一种对被分析物亲和力更强的溶剂洗脱;另一种是存在的生物介质较被分析物与固相之间亲和力更强,则被分析物被直接洗脱。通常使用的为前一种模式。
 
  SPE方法早的SPE方法是,将含有被分析物的液相倒入盛有适当吸附剂的器皿中,振摇一定时间,使被分析物在两相间分配达平衡,通过过滤或倾泻的方法实现两相的分离。如果吸附剂有效,则大部分被分析物被吸附于固相,然后再用适当的溶剂使之解吸附即可。
 
  现代SPE方法采用长约2~3cm的聚丙烯小柱,内装各种填料,两端装有烧结片或多孔圆片,可通过加压或抽负压的方法使液相经过小柱,实验步骤如下:
 
  步:使用甲醇润湿小柱,活化填料,以便固相表面易于和被分析物发生分子间相互作用,同时,可以除去填料中可能存在的杂质。李增标等比较了柱的湿润性对多种药物吸附的影响后指出,C18柱在甲醇含量大于8%的水溶液中才能保持湿润而有利于药物的吸附,否则,将导致回收率的降低。
 
  第二步:用水或适当的缓冲液冲洗小柱,转移过多的甲醇,以便样本与固相表面发生作用。但清洗不宜过分,否则会使甲醇含量过低,从而导致湿润度不足,回收率降低。
 
  第三步:加样,使样本经过小柱,弃去废液。
 
  第四步:用水或适当的缓冲液冲洗小柱,转移样本中的内源性杂质和其他相关杂质。
 
  第五步:选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物,收集洗脱液,挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。
 
  以上的操作步骤为分析工作者广泛采用,同时人们正在努力尝试新的技术。为了提高洗脱纯度,缩短溶剂蒸发时间,Liu等将超临界流体萃取技术(SFE)与SPE技术联用,选择ODS柱,操作至第四步后,将填料移至萃取管置于SFE系统的限制器中,然后以CO2-5%甲醇作为超临界流体洗脱分析物,分别采用GC-MS和HPLC分析了狗血浆中痕量的美贝维林醇和黄酮,与SPE方法比较,其回收率略低,但也达到90%左右。
 
  近年来,SPE技术更加趋于微量化,出现了用于SPE的膜片以及固相微萃取技术(SPME)。SPE膜片技术是将吸附剂固定在一卷微纤维上,置于SPE膜内,其厚度仅为0.5mm,可允许更高流速通过,对于大量的低浓度样本非常实用,可以实现有效的浓集并房与HPLc系统相联,Kwakman以此对水中有机磷杀虫剂进行了在线检测。SPME技术中的固相为一纤维,可以是熔融石英或覆盖聚二甲基硅氧烷的熔融石英,聚酚亚胺,液晶聚丙烯酸酯,聚乙二醇或石墨。该纤维被置于一个微量注射器的针腔内,使用时将针筒推入,则纤维降低,放大样品液中一段时间,在转子搅拌下,药物被吸附,然后将纤维退回进样针内,当迸样针插入GC进样口时,样品发生热解吸附,从而进入分析柱中。Page等采用SPME-顶空GC分析了食物中的挥发性物质。
 
  2、SPE填料
 
  可应用于SPE的填料种类繁多,其中,吸附型的有:活性炭,硅胶,硅藻土,硅酸镁,氧化铝等。就化学键合相硅胶而言,正相的有:氨基,腈基,二醇基等;反相的有:C1,C2,C6,C8,C18,腈基,环己基,苯基等;离子交换的有:季胺,氨基,二氨基,苯磺酸基,羧基等。此外还有聚合物,如苯乙烯-二乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等。相对于键合相填料,聚合物可适用于全部pH范围,因而用途更广。通常,人们可以根据需要选择填料自行装柱,而众多的商品化小柱为分析的便利及精密提供了可靠的保证。目前,世界上多个公司都生产SPE柱,如AnalytichemInt公司的Bond Elut、Waters公司的Sep-Pak系列小柱已广泛地用于各种分析工作中;国内也有厂家生产SPE小柱,如河北津杨滤材厂的PT系列
 
  近年来,HPLC发展的另一热点在于多种新型填料的问世,受其影响,SPE小柱也出现了一些更具选择性的填料……苯基硼酸(phenylboronicacid,PBA)键合硅胶被用于选择性地萃取血浆中的一系列β-拮抗剂,其作用机理在于药物与填料以共价键结合,较为专属地保留该类含醇羟基的药物。双硫腙或二硫代氨基甲酸盐键合硅胶,其作用机理为离子交换,可选择性地保留重金属。内表面反相吸附剂(internal surface reversed-phase,ISRP)先用于HPLC,该种填料孔隙的内表面经化学修饰,而外表面不经修饰,处理血样时无需转移或沉淀蛋白。因为蛋白质等大分子不能渗入孔隙内部,很快被洗脱,而小分子药物则进入孔隙内部被保留。将填料表面经化学修饰后,结合金属离子,形成金属离子覆盖相。该种固相通过药物与金属离子之间形成复合物,从而保留药物。Van der Vlies等利用Fe3+覆盖的8-羟基喹啉键合硅胶,专属地将阿霉素从血浆中萃取出来。环糊精键合的硅胶与药物结合,可形成分子排阻型复合物滞留药物。Agarwd等成功地用β-环糊精键合硅胶萃取了一系列磺胺类药物。此外,免疫亲和色谱(Immunoaffininty Chromatography,IAC)的发展,也使人们采用免疫亲和固相,从事生物样本的纯化,即制备一种专属性的抗体,将其固定在琼脂糖或硅胶上,当样品通过时发生抗原-抗体结合,从而专属性地萃取药物,该方法在生物活性大分子的分离分析中尤为重要。
 
  3、SPE的自动化
 
  在生物样本分析中往往要处理大量的样本,虽然SPE的引入使得单个操作较为省时,但大量的重复操作仍是相当耗时的。因此,一段时间内,人们都在设法实现自动化,以使人们从冗长的重复劳动中解脱出来。目前的自动化仪器可分为半自动和全自动两种,半自动SPE是指萃取过程机械化,但将洗脱液转移到进样阀则需手工操作;而全自动SPE则是真正的在线操作,整个的萃取和分析过程都由机器控制完成。
 
  早的自动化仪器为Du Pont公司的"Prep"系统和Analytichem Int公司的"AASP"。前者属半自动SPE,萃取的操作是在一个转子上依靠离心力完成的;后者属全自动SPE,它采用十通阀,利用切换技术完成全部过程。
 
  如今的半自动SPE,一般都是将样品,小柱,萃取液,废液管及流分收集管置于特定的架子上,使用机械手及注射泵操作。先从各个专门的瓶子或试管中吸取液体,注入相应的小柱中,注射泵加正压,使液体通过小柱。后,用注射器吸取洗脱液,送入进样口。该类型的商品化仪器较多,如GilSon公司的"As-pec XL",Hami1ton公司的"Microlab SPE",Millipore公司的"MilliIab Workstation"和Hewlett-Packard公司的"HP7686Prepstation"等。
 
  全自动的SPE仍是通过柱切换技术实现的。采用普通的六通阀与HPLC联用,填料一般装于不锈钢小柱中,以适应系统的高压。该小柱处于色谱进样阀中定量管的位置,当进样阀在Load位置,样品被泵入小柱,分析物被保留。同时。流动相由另一泵泵入分析柱。当预浓集过程完成后,进样阀置于Inject位置,流动相通过小柱,将分析物转移至分析柱中。这种系统也可被认为是"预柱"或"双柱"系统,它的缺点是在高压接头状态引入小柱,使得不同样品分析时更换小柱较为困难,因而一次分析完成后需冲洗小柱。现在,可更换柱的商品化仪器也有出现,如荷兰Spark公司的"Prospect"及Merck公司的"OSP-2"系统。
 
  4、SPE在生物样本分析中的应用
 
  SPE技术与LLE技术相比,在生物样本分析方面确有较多优势,因而近年来应用不断增多。在80年代初期,每年该方面的论文极少,而90年代以来,每年都有百篇左右的论文发表。
 
  Okazaki等研究奥弗拉辛及其二甲基和N-氧基代谢物时,比较了SPE和LLE的提取回收率,用LLE法提取时,上述三种物质的回收率分别为39.5%,54.7%和小于5%,而用C8 SPE柱,则所有分析物回收率均达98%。Wientjes等采用LLE提取血浆中2‘,3-二去氧次黄嘌呤核苷(2’,3-dideoxyinosine)时回收率仅33%,而采用C18 SPE柱则获得了90%以上的回收率。
 
  SPE技术萃取的性常为分析方法的灵敏度提供可靠的保证。Wells等为了研究布美他尼的药动学,从新生儿体内取得0.2m1血浆及尿样进行分析。在此之前,由于LLE方法需获得较大量的样本,这在临床上对新生儿及婴儿的研究是不可能的,而采用SPE,利用其可以处理微量样本的特点,则获得了成功。Moriyama等应用C18柱萃取,仅用20ml血浆,同时测定了抗癫痫药扑米酮及其活性代谢产物苯乙基丙二酚和苯巴比妥。Lu等以SPE-柱后光反应的HPLC荧光检测法测定了血浆中痕量的甲氨喋呤和7-羟基甲氨喋呤,其中甲氨喋呤的低检出限为0.05ng/ml。Stafford等采用二羟基及C18 BondElut小柱处理血浆中抗癌药GI147211的内酯及羧基型成分,低检出量分别为0.05 ng/ml和0.l ng/ml。Lacroix等建立了SPE-HPLC荧光检测法测定了人血浆中的神经肌阻滞剂米伐库铵(mivacurium chloride)对映异构体及其代谢物,其检测灵敏度可达3.9ng/ml。
 
  Svensson等利用SPE技术的快速、性,作为硫利达嗪临床分析的方法,认为该技术用作常规分析大量生物样本十分便利。See等采用Sep-Pak小柱将LTD4拮抗剂MK0476从介质中萃取,以离子色谱法分析了原料药中残留的醋酸盐。Chen等应用ASPEC系统进行了体液中药物的筛选。Muro等以C18小柱萃取尿中的丙戊酸肉碱,随后以GC-MS方法进行测定,从而评价抗惊厥药物丙戊酸的治疗水平。Casas等对体液中一系列的1,4-苯骈二氮杂章类药物进行了研究。Kupferchmidt等研究爱滋病患者血样中3-迭氮基-3-去氧胸腺嘧啶脱氧核苷(3-azido-3-deoxythymidine)时指出,SPE方法使样本处理大程度地被精减为实验操作的安全提供了保障。
 
  SPE由于多采用商品化小柱,价格较为昂贵,但是,由于小柱具有重复使用性,因而,该方法仍有较强的实用价值。Milne等重复使用C18 SPE柱,处理了14次吗啡及其代谢物的血浆样本,精密度仍很满意。Van de Water等使用羧基二咪唑(carbonyldi-imidazole)填料的小柱,重复30次以上,并未发现明显的柱效下降。
 
  结语:
 
  SPE技术的出现使生物样本处理过程大为简化,自动化SPE的使用真正实现了生物样本的在线分析。但是,专属性填料的开发尚处于起步阶段,而自动化仪器仍有待于进一步完善,尤其是全自动系统中,如何使小柱更为耐压且易于更换,值得进一步研究。尽管如此,仍然有理由相信SPE技术会逐步成熟,在样本处理技术中处于主要地位。
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